cGAS-STING通路是负责识别胞质DNA免疫应答的主要通路1。cGAS作为胞质DNA受体，可以被DNA和/或Mn2+激活并利用ATP和GTP合成第二信使2'3'-cGAMP，后者进一步激活STING并诱导I型干扰素等细胞因子的产生，从而介导抗感染/肿瘤免疫反应。研究表明，多种病原微生物入侵及各种压力胁迫，如氧化应激、代谢紊乱及DNA损伤等都可导致胞质DNA的累积及Mn2+浓度的升高，从而激活cGAS-STING通路。因此，cGAS-STING信号通路在抵抗病原微生物感染、肿瘤及多种免疫相关疾病的发生及治疗中都发挥关键作用。
磷脂酰肌醇磷酸（phosphoinositides，PIPs）是构成真核生物细胞膜组分的重要磷脂（占总磷脂的5—10%），也是重要的信号分子2。由于肌醇六元环上D-3、D-4或D-5位都可发生磷酸化修饰，因此真核生物中总共存在7种不同PIP分子。PI4P（phosphatydyinositol 4-phosphate）是胞内含量最高的PIP分子，广泛分布于各种膜组分，且在反式高尔基体（trans-Golgi network，TGN）上的含量最高。细胞中的PI4P的含量主要受其合成酶PI4Ks（PI4KA、PI4KB、PI4K2A和PI4K2B）和降解酶SAC1的调控。PI4P不仅是合成PIP2和PIP3的前体，也是重要的信号分子，在膜泡运输、脂质转运和细胞器形态维持等方面发挥关键作用。
2021年，北京大学生命科学学院/北大-清华生命科学联合中心的蒋争凡教授实验室利用STING自激活突变体诱导细胞死亡的特性，在HT080细胞中进行了基于CRISPR-Cas9介导的全基因组筛选，发现高尔基体腔内合成的硫酸化糖胺聚糖（sGAGs）可以通过结合到STING跨膜区的腔内侧，从而诱导STING的寡聚及激活3。该论文的讨论部分提到STING和sGAGs的相互作用受到STING腔内侧pH值的调控，并由此推测STING在pH更低的后高尔基体囊泡（post-Golgivesicles）中会有更高的活性。但是在这项研究中，他们没有解释STING为什么需要及如何转运到后高尔基体囊泡。
2023年3月14日，蒋争凡实验室在Immunity上以research article形式在线发表了题为“ARMH3-mediated recruitment of PI4KB directs Golgi-to-endosome trafficking and activation of the antiviral effector STING”的论文，报道了ARMH3作为接头蛋白招募PI4KB到STING，PI4KB通过合成PI4P促进STING从高尔基体到内体的转运（Golgi-to-endosome trafficking）及维持STING激活所需要的脂膜环境（lipiden vironment），从而帮助STING更加稳定高效地激活。
本工作首先通过CRISPR-Cas9介导的全基因组筛选在HeLa细胞系中鉴定到一个未知功能的新基因C10ORF76（又名ARMH3）对STING的激活十分重要（图一A）。ARMH3是一个鲜少被研究的蛋白，为数不多的几篇文章暗示了它对于PI4KB发挥激酶活性来磷酸化磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol，PI）生成PI4P十分重要。免疫荧光实验发现STING激活后和ARMH3、PI4KB及PI4P都在反式高尔基体有明显的共定位。进一步免疫共沉淀实验显示，STING只有在ARMH3存在的情况下和PI4KB有互作（图一B），表明ARMH3在STING和PI4KB之间起到桥梁作用。进一步实验表明，ARMH3分别结合位于STING第二、三跨膜区之间的连接区域及位于PI4KB激酶结构域中间的连接区域。突变掉STING负责结合ARMH3的氨基酸或者利用CRISPR-Cas9原位删除PI4KB与ARMH3互作的关键区域（6个氨基酸残基）都会显著削弱cGAS-STING通路的激活。这些结果表明，ARMH3招募PI4KB对于STING的激活十分关键。更重要的是，细胞内敲除ARMH3或者原位删除PI4KB结合ARMH3所需的6个氨基酸，STING在上游通路活化后几乎呈现完全的内质网定位，暗示如果2'3'-cGAMP结合后被转运到高尔基体的STING无法被继续转运到后高尔基体囊泡，将会被细胞内COPI/AP1介导的从高尔基体向内质网的逆向转运运回内质网，并完全抑制STING的活化。
为了更直接地研究PI4KB对STING激活的影响，研究者使用雷帕霉素诱导的FKBP和FRB相互作用，直接招募PI4KB-GFP-FKBP到STING-mCherry-FRB，并发现招募PI4KB到STING会显著促进STING聚集体的形成及下游信号通路的激活（图一C），且这种对于STING通路的激活能力完全依赖于PI4KB的激酶活性。相反，招募PI4P的磷酸酶SAC1到STING则会抑制STING聚集体的形成及下游信号通路的激活。表明PI4KB通过在STING周围合成PI4P促进STING的激活。有趣的是，SAC1的敲低会引起细胞内PI4P水平的异常升高，进而导致STING不依赖于cGAS的自激活。TMEM39A是一个自身免疫性疾病相关基因且被报道参与细胞内的PI4P水平的调控4。同样，TMEM39A的敲低也会导致细胞内PI4P的水平的异常升高及STING的自激活，该发现有助于理解TMEM39A相关自身免疫疾病的致病机制。此外，SCAP 和NPC1的突变也被报道可以引起细胞内PI4P的水平的异常升高及STING的自激活5—8，提示胞内PI4P水平的异常升高可能是这些基因突变导致STING自激活的共同原因。
为了研究PI4P如何影响STING的激活，研究者对23个PI4P结合蛋白进行了系统性的敲低并发现其中9个成员的降低表达会使STING的激活严重受损（图一D）。功能分析表明，这9个PI4P结合蛋白可以分为两类。其中AP-1和GGA2负责介导高尔基体到内体的膜泡运输。由于内体中相对更低的pH值有利于STING与sGAGs的结合，他们推测PI4P可以通过指导AP-1和GGA2介导的clathrin-coated vesicles (CCVs)将STING从高尔基体转运到内体从而避免STING被运回内质网，并且更加强烈激活STING。另一类PI4P结合蛋白均为脂质转运蛋白，其中OSBP和ORPs负责从内质网向高尔基体或内体转运胆固醇，CERT负责神经酰胺从内质网到高尔基体的转运。神经酰胺在高尔基体上会在SGSM1的催化下转化为鞘磷脂，且SGSM1在细胞内的敲除会显著削弱STING的激活，提示鞘磷脂而非神经酰胺直接作用于STING。通过特异的化学小分子破坏胆固醇和鞘磷脂在脂膜上的分布会使STING聚集体逐渐消散并显著抑制STING下游信号通路的激活，表明胆固醇和鞘磷脂对STING聚集体的形成和激活十分关键。以上结果共同表明，PI4P还可以通过脂质转运蛋白维持STING活化所需的脂膜环境进而影响STING的激活。此外，Lyz-Cre介导的Armh3条件敲除小鼠实验表明Armh3在机体对抗DNA病毒感染过程中发挥关键作用。
综上所述，该研究发现：1）STING为什么需要离开及如何离开高尔基体【后高尔基体转运（post-Golgi trafficking）】的分子机制（图二）；2）一个功能未知蛋白ARMH3（可能还具有GEF活性，激活膜泡转运中非常重要的Small GTPase Arf1）在cGAS-STING通路中的重要作用；3）脂膜环境对STING的活化十分关键；4）细胞内PI4P水平的异常升高可以导致非依赖于cGAS的STING分子自激活（cGAS-independent STING autoactivation）。重要的是，这种现象在很多脂质代谢紊乱的自身免疫病患者中被发现及报道。鉴于PI4P在脂质运输及脂质稳态维持中的核心作用，该研究还提示，STING作为一个潜在的细胞脂质稳态感受器（lipid homeostasis sensor），可能是细胞内的一种新型危险信号感受器。
北京大学生科院博士后方润和蒋启飞为该文章的共同第一作者，2022级研究生贾新颖也为本研究作出贡献。蒋争凡为通讯作者。本研究工作得到了国家自然科学基金委、科技部国家重点基础研究项目、北京大学“细胞增殖与分化”教育部重点实验室及北大-清华生命科学联合中心的资助。
参考文献：
1. Fang, R.et al. Recent advances in the activation and regulation of the cGAS-STING pathway. Advances in Immunology 156, 55—102, doi:10.1016/bs.ai.2022.09.003 (2022).
2. Posor, Y. et al.Phosphoinositides as membrane organizers. Nat Rev Mol Cell Biol, doi:10.1038/s41580-022-00490-x (2022).
3. Fang, R. et al. Golgi apparatus-synthesized sulfated glycosaminoglycans mediate polymerization and activation of the cGAMP sensor STING. Immunity 54, 962—975, doi:10.1016/j.immuni.2021.03.011 (2021).
4. Miao, G. et al. The ER-Localized Transmembrane Protein TMEM39A/SUSR2 Regulates Autophagy by Controlling the Trafficking of the PtdIns(4)P Phosphatase SAC1. Mol Cell 77, 618—632 e615, doi:10.1016/j.molcel.2019.10.035 (2020).
5. Wakana, Y. et al. The ER cholesterol sensor SCAP promotes CARTS biogenesis at ER-Golgi membrane contact sites. J Cell Biol 220, doi:10.1083/jcb.202002150 (2021).
6. Kutchukian, C. et al. NPC1 regulates the distribution of phosphatidylinositol 4-kinases at Golgi and lysosomal membranes. EMBO J 40, e105990, doi:10.15252/embj.2020105990 (2021).
7. York, G. et al. Limiting Cholesterol Biosynthetic Flux Spontaneously Engages Type I IFN Signaling. Cell 163, 1716—1729, doi:10.1016/j.cell.2015.11.045 (2015).
8. Chu, T. et al. Tonic prime-boost of STING signalling mediates Niemann-Pick disease type C. Nature 596, 570—575, doi:10.1038/s41586-021-03762-2 (2021).
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