在生命起源研究中，“RNA世界”（The RNA World）是目前影响最大的假说之一，即存在一个早期生命体系，由RNA同时承载遗传编码和实施催化功能。“RNA世界”假说虽然受众较广，但其中多个核心问题尚未解决，如核糖的生成、碱基的形成、核苷化、磷酸化和核苷酸的聚合。在核苷化这一关键步骤中，由于嘌呤N9位和嘧啶N1极弱的亲核性，使得碱基和核糖直接缩合形成糖苷键成为困扰研究者们的难题。自1970年代Leslie Orgel开始探索核苷化以来，该反应一直存在产率低、选择性差、与原始地球环境不符等挑战。对于嘌呤而言，糖苷键优先形成于NC6位而非RNA中的N9位，而嘧啶的直接核苷化几乎没有先例（图1）。
图1."RNA世界"假说中的糖苷化问题
化学化工学院王晓课题组一直致力于生命起源研究及其和现代化学技术的结合（Nat. Catal. 2019, 2, 98–102）。在前期研究中，针对核糖的自然选择这一生命起源中的重要难题，提出并证明了遍布地壳的黏土及其吸附的金属离子（MDC）可作为一个“天然固定相”，将核糖从复杂的混合糖中分离出来，并采用模块化的流动化学系统模拟了MDC动态吸附核糖的过程（Chem 2021, 7, 3292–3308）。对于碱基的核苷化，借助微通道反应器发现了空化效应对于嘌呤核苷N9选择性的促进作用，反应以水分子作为催化剂，为实现绿色糖苷化提供了新思路（Cell Rep. Phys. Sci. 2021, 2, 100375）。近日，王晓课题组在核苷的前生物合成方面取得新进展，发现了金红石、锐钛矿及各种钛酸盐对核苷化的区域选择性有极大的提升作用。以此为基础，深入研究了原始地球环境下核糖和嘌呤或嘧啶碱基的缩合反应，首次实现了对N9位（嘌呤）和N1位（嘧啶）的选择性核苷化，也借此发展出一种无需保护基团的水相糖苷化方法，相关成果发表于Nature Synthesis。
在探索核苷化问题的过程中，作者通过调研，发现已报道的核苷化反应中均添加了可溶性离子来模拟原始海水，如NH4+、Na+、K+、Ca2+、Mg2+和Mn2+等，但未曾使用过不溶性矿物。TiO2是用途广泛的非均相催化剂，且钛元素在地壳中质量丰度为0.63%，位列第九，在原始地壳中也应大量存在，引起了作者的关注。TiO2表面具有酸性（Ti）和碱性（O）位点，或许有助于同时活化核糖和碱基以生成糖苷键。因此，作者研究了常见含钛矿物存在下的一系列核苷化反应。
首先，作者初步尝试了钛铁矿（FeTiO3）存在下的腺嘌呤核苷化，在pH = 1，75°C下将反应混合物敞口蒸干。腺嘌呤核苷化理论上可生成8种产物异构体（图1），故完善的产物分析是开展该项工作的先决条件。通过总离子色谱（TIC，图2b）和密度泛函理论计算（DFT，图2c）验证，作者初步确定了AN9和ANC6这两类产物的分组。随后，将反应混合物与Carell课题组提出的间接路线的产物（Science 2016, 352, 833）以及α-腺苷和β-腺苷标样做混合进样，进一步确定了4种AN9异构体。最后，用制备级色谱柱分离出各个产物，通过1H NMR完全确认了3种ANC6异构体和4种AN9异构体。可喜的是，该反应具有极高的N9产率（∑AN9 = 8.9%）和前所未有的∑AN9/∑ANC6比率（1.1/1）。
图2. FeTiO3促进的腺嘌呤核苷化及AN9异构体的几何优化
作者继而探索了在原始地球的“湿干循环”条件下，各种钛矿对于核苷化的促进作用。作者尝试采用不同类型的二氧化钛（金红石和锐钛矿）和钛酸盐（CaTiO3和FeTiO3），在更温和的温度下（70°C）将水蒸干，再补充水至原体积，于70°C下再次蒸干。重复循环9轮，每轮循环后测定反应产率和选择性（图3a-d）。结果显示，金红石和锐钛矿对于N9核苷化展现出较高活性（∑AN9分别为13.9%和13.4%），而FeTiO3和CaTiO3则活性略低（∑AN9为12.7%和12.9%）。除了实现比单次蒸干更高的∑AN9/∑ANC6比率（13:1）外，还生成了很多β-腺苷（3.6%）。此外，作者开展了有/无钛矿的对照实验，以及FeTiO3/FeCl2的对照实验，证明了钛矿对于N9选择性有着不可或缺的作用。
接下来，作者将上述反应条件用于鸟嘌呤和尿嘧啶的核苷化。鸟嘌呤核苷化存在12种可能的产物，增加了产物分析的难度。为此，作者将反应混合物与Carell路线的产物及β-鸟苷标样分别混合进样，通过TIC确定了4种GN9产物。经历9轮湿干循环后，金红石和FeTiO3催化的反应中∑GN9分别保持在15%和10%左右，而两组反应分别获得5%和6%的β-鸟苷（图3e-f）。此外，作者还尝试仅在1次蒸干后就将反应混合物置于50 °C和pH 10之下，使双核苷化产物选择性水解，10天后的∑GN9高达19%，而β-鸟苷产率高达6.7%，这也是迄今为止β-鸟苷的前生物合成所能达到的最高产率。对于尿嘧啶的反应，高分辨质谱（HRMS）显示有核苷化产物生成，而LC-MS和TIC进一步显示有少量β-尿苷生成，尽管其产率很低，但意义依旧重大。
图3. 湿干循环条件下钛矿促进的碱基糖苷化产率和选择性
考虑到原始地球环境下质子浓度有限，对于需要一定酸性的核苷化反应而言，将质子保存在矿物表面显得尤其重要。因此，作者对钛矿吸附质子的能力进行了定量探究（图4a），在有/无钛矿存在的条件下，分别蒸干pH = 3的盐酸溶液，加水稀释后，含有钛矿的溶液pH值比无钛矿的溶液低0.4至0.8，证明了钛矿具有吸附质子的能力（图4b-c）。由此证明，起始溶液不必具有强酸性，对于非挥发性的酸（如磷酸）更是如此。因此，作者以pH = 4为起始条件尝试腺嘌呤的核苷化（图4d），在7轮湿干循环后，依然得到不错的结果，∑AN9达到11.6%，β-腺苷产率达2.6%。
图4. 钛矿吸附质子实验
最后，作者研究了该反应可能存在的多种机理（图5a）。在酸和钛矿的作用下，碱基与核糖发生直接糖苷化生成N9核苷（路径1），或NC6产物（路径2），或双核苷化产物（路径3）。经实验证明，早期湿干循环中，N9核苷的产率升高应归因于路径1中酸和钛矿的共同促进作用。但在后期循环中，N9核苷的增长与NC6产物的消耗基本持平，因此作者推断存在路径2，即NC6产物水解后，在钛矿作用下重组生成更稳定的N9核苷。对照实验证明，钛矿对路径2的发生有明显的促进作用（图5b）。而LC-MS和TIC数据证明了双核苷化产物的存在（路径3）。为进一步阐释机理，作者通过红外光谱（图5c）和X射线光电子能谱（图5d），研究了嘌呤、嘌呤二氧化钛混合物、嘌呤氧化铝混合物的光谱特征，分析了钛矿和嘌呤间可能存在的特殊作用，以解释钛矿对N9区域选择性的提升。
图5. 核苷化的三种路径和机理研究
综上所述，王晓课题组报道了一类钛矿促进的区域选择性核苷化反应，填补了“RNA世界”假说中的一项空白，同时开发了一种无保护基团的水相合成糖苷键的绿色化学方法。在含钛矿物的作用下，N9腺苷可实现14%的总产率（其中β-腺苷达3.6%），且具备优异的区域选择性（N9/NC6达13:1）。对于鸟嘌呤，实现了β-鸟苷迄今为止的最高产率（6.7%）。对于N1位亲核性极弱的嘧啶类碱基，也检测到了核苷化产物。这项研究表明，采用特定的不溶性矿物，能够极大地影响核苷化反应的产物分布；之前观测到的NC6产物占主导很有可能是动力学因素导致。而N9核苷之所以成为RNA的主体并延绵至今，是因为它的热力学稳定性。在矿物的作用下，漫长的地质年代会将动力学产物逐渐转变为热力学产物。
相关成果以“Regioselective ribonucleoside synthesis through Ti-catalysed ribosylation of nucleobases”为题发表于Nature Synthesis（DOI:10.1038/s44160-022-00206-1）。2019级硕士研究生（2022级博士研究生）陈倩倩为该论文的第一作者，2020级博士研究生赵泽润和研究助理叶尔森•帕特合别克为该项工作做了重要贡献，王晓副教授为通讯作者。
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