膜电位（membrane voltage，Vm）是细菌重要的自由能来源，是其进行氧化磷酸化、膜转运以及鞭毛运动等的主要驱动力，具有应激调节、信号传递等重要生理意义。以往人们认为细菌膜电位是静态的，直到近期有研究发现细菌膜电位可以介导生物膜中细菌之间的信息通讯（1,2）。因此，细菌电生理学是一个创新的研究方向。然而，与真核细胞相比，细菌电生理学的研究进展缓慢，主要是缺乏在单细胞水平上能以高时空分辨率实时监测细菌膜电位动态变化的工具。
2023年1月9日，北京大学生物医学前沿创新中心（BIOPIC）、北京未来基因诊断高精尖创新中心（ICG）、生命科学学院白凡教授课题组在PNAS杂志上发表题为“Sensitive bacterial Vm sensors revealed the excitability of bacterial Vm and its role in antibiotic tolerance”的研究论文，报道了新型基因编码的高时空分辨率细菌膜电位指示探针ViBac，利用该探针首次发现了细菌膜电位存在类似神经细胞的电“兴奋”和“静息”状态，并通过进一步的研究揭示了细菌膜电位的动态变化对细菌抗生素耐药的重要影响。
研究团队报道了两种用于追踪细菌膜电位变化的基因编码的荧光探针（Voltage Indicator for Bacteria，ViBac），其中，ViBac1是单色荧光探针；ViBac2是比率型双通道荧光探针。结构照明显微镜技术（SIM）显示ViBac探针可准确锚定在细菌膜上。通过验证ViBac对去极化及超极化试剂的响应、外加电场诱导膜电位变化等一系列的表征实验，证明ViBac1具有较高的时间分辨率，可在单细胞水平实现对膜电位的实时动态表征；ViBac2则可应用于细菌间膜电位的异质性研究（图1）。
图1. 新型基因编码的细菌膜电位指示探针的开发与表征
利用ViBac探针，研究团队首次报道了细菌膜电位的重复性瞬时超极化现象。在PBS和M9 salt溶液中，对数生长期的大肠杆菌中ViBac1信号动态差异显著。在PBS溶液中，ViBac1探针信号频繁“闪烁”（Spike），指示细菌膜电位持续波动；而在M9中，膜电位则相对稳定。通过进一步对比PBS和M9 salt的成分，研究团队发现细菌此类兴奋现象是被高钠低钾的环境触发的（图2）。并且ViBac探针在多种革兰氏阴性与革兰氏阳性菌中可指示这样的瞬时超极化现象，这说明Spike现象可能是多菌种间的普适性现象。
图2. ViBac1揭示对数期细菌膜电位在PBS和M9盐中的不同动态变化
接下来，研究团队利用钾离子荧光指示探针探针和电感耦合等离子体发射光谱追踪细菌内离子浓度的变化，结果显示细菌的Spike现象伴随着显著的钾离子的外流。除此之外，Spike现象依赖于细菌的代谢状态，当抑制细菌代谢，细菌Spike现象也受到显著抑制（图3）。更有趣的是，通过进一步的研究发现，这种瞬时超极化现象增强了细菌的外排活性，并增强了细菌对抗生素的耐受性。通过ViBac1对细菌膜电位动态的追踪，研究团队发现细菌膜电位动态的异质性特征对研究细菌的抗生素耐药具有重要意义。
图3. 对数期细菌的兴奋性及其与代谢状态的关系
不同于对数期细菌，稳定期的细菌即便在高钠低钾环境中，也不存在Spike现象，膜电位相对稳定。细菌膜电位对细菌耐药性的研究早有报道，然而存在诸多争议，且鲜见单细胞水平的报道。为了探究稳定期细菌膜电位同细菌抗生素耐受性的关系，研究人员利用ViBac2揭示了稳定期细菌群体中的膜电位异质性，以及其同细菌抗生素耐受性的关系。在抗生素处理前，膜电位相对较高的细菌，大多被抗生素杀死，而膜电位相对较低的细胞更有可能是持留菌persister（一种表型耐药细菌，在抗生素处理过程中存活，且在撤去抗生素后，可恢复生长）。然而，膜电位最低的一群细胞，则是VBNC（存活但不可培养的细胞，viable but non-culturable cells）（图4）。在白凡课题组之前的工作中（2019年在Molecular Cell杂志上发表题为“ATP-dependent dynamic protein aggregation regulates bacterial dormancy depth critical for antibiotic tolerance”的论文），曾提出“休眠深度dormancy depth”的概念，即persister是处于浅休眠深度的细菌，而VBNC处于较深休眠深度。研究人员指出，膜电位将作为休眠深度的一个重要指标，对研究耐药细菌对抗生素应激机制的形成和调节具有重要的临床意义。
图4. ViBac2揭示稳定期细菌膜电位与抗生素耐受性相关
本研究证明新型细菌膜电位荧光探针ViBac可在高时空分辨率下实现在单细胞水平追踪细菌膜电位的动态变化。利用ViBac探针，揭示了细菌膜电位可呈现出的“兴奋”和“静息”两种状态以及其与抗生素耐药之间的联系。ViBac探针的开发将为细菌电生理学的研究注入新的活力，而基于细菌膜电位的研究或许能为解决细菌耐药问题提供新的思路和策略。
北京大学生物医学前沿创新中心、生命科学学院金心博士，本科生张晓维（现博士就读于美国斯坦福大学），北京大学前沿交叉学科研究院博士研究生丁雪婧，北京大学BIOPIC田甜博士为本论文的并列第一作者。白凡为本论文的通讯作者。该研究得到了北京大学生命科学学院李毓龙教授、化学与分子工程学院邹鹏教授的支持与帮助，得到了国家自然科学基金委、北京未来基因诊断高精尖创新中心的经费支持。
参考文献：
1.A. Prindle, J. Liu, M. Asally, S. Ly, J. Garcia-Ojalvo, G. M. Süel, Ion channels enable electrical communication in bacterial communities. Nature. 527, 59–63 (2015).
2.J. M. Benarroch, M. Asally, The microbiologist’s guide to membrane potential dynamics. Trends Microbiol. 28, 304–314 (2020).
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