水杨酸（Salicylic acid，SA）是植物体内调节自身免疫的重要激素，参与植物的生物胁迫和非生物胁迫响应。前期研究表明，植物中存在两条水杨酸合成途径：异分支酸合成酶（Isochorismate Synthase，ICS）途径和苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine Ammonia Lyase，PAL）途径。在拟南芥中，病原菌或紫外诱导的水杨酸生物合成大约90%是通过ICS途径合成，剩下的大约10%被认为是通过PAL途径合成。目前，ICS途径中的基因已被一一解析，但是PAL途径合成SA的相关组分尚未报道，拟南芥中SA是否来源于苯丙氨酸也缺乏确凿的证据。
JIPB近日在线发表了中科院深圳先进技术研究院赵乔课题组题为“Salicylic acid biosynthesis is not from phenylalanine in Arabidopsis”（https://doi.org/10.1111/jip？b.13410）的“突破性报告”（Breakthrough Report）。该研究发现，在拟南芥中，苯丙氨酸不能合成SA（2-Hydroxybenzoic acid，2-HBA），而是合成SA的同分异构体4-羟基苯甲酸（4-Hydroxybenzoic acid，4-HBA），推翻了近30年来苯丙氨酸解氨酶途径合成SA的假设。
图.拟南芥中水杨酸合成的途径
（A）苯丙氨酸合成SA的同分异构体4-HBA；（B）PAL内源活性增强不影响[13C6]-SA的合成；（C）IC途径合成SA，PAL途径合成SA的同分异构体4-HBA
PAL途径合成SA的证据来源于两方面。一是通过[13C1]-或者[2H6,18O]-等同位素标记前体饲喂实验发现苯丙氨酸可以经反式肉桂酸、苯甲酸（Benzoic Acid，BA）进而合成SA。但是，[13C1]-标记实验不能区分来源于同位素标记前体的13C和天然的同位素峰，而2H-或者18O-标记则可以通过溶液中氘原子的交换或羧酸氧在溶液中通过脱质子作用的自发相互转换而获得。此外，生化证据表明BA可以生成SA，推测苯甲酸可能被BA2H（Benzoic Acid 2-Hydroxylase）羟基化产生SA，但在植物体内编码BA2H的基因尚未被发现。二是PAL基因可以影响植物与SA相关的系统获得性抗性。但是PAL是苯丙烷途径的第一个关键酶，可以影响许多其他防御相关的化合物的合成和代谢。
赵乔课题组首先通过稳定同位素标记苯环的[13C6]-Phe进行示踪实验发现，用[13C6]-Phe饲喂野生型拟南芥后，检测不到[13C6]-SA的生成，取而代之的是SA的同分异构体[13C6]-4-HBA。分别在SA缺陷突变体和SA积累突变体中进行饲喂实验，仍然检测不到[13C6]-SA，也检测不到SA的前体[13C6]-BA。但是，饲喂[13C6]-BA，可以检测到[13C6]-SA的生成，说明苯丙氨酸在拟南芥中不能生成SA，而是合成其同分异构体4-HBA；BA可以生成SA，可能是由于植物体内其他基因的冗余功能。为了证实这一推论，本研究首先在利用丁香假单胞杆菌诱导SA的同时饲喂[13C6]-Phe，无论用Pst DC3000还是Pst DC3000（AvrRpm1）处理拟南芥，在SA诱导积累10-20倍含量的情况下，SA仍然不能被[13C6]-Phe标记，只能检测到[13C6]-4-HBA的生成。其次，由于KFB（Kelch domain-containing F-box）蛋白可以影响拟南芥内源PAL蛋白的稳定性，该研究构建了在kfb突变体背景下的PAL基因的过表达植株。PAL内源蛋白水平提高后，其活性得到了明显提升，4-HBA的含量也得到了相应的积累。在PAL过表达植株中饲喂[13C6]-Phe，仍然只检测到[13C6]-4-HBA的生成。因此该研究揭示了拟南芥中SA的合成并不来源于苯丙氨酸，推翻了关于苯丙氨酸解氨酶途径合成SA的假设，也为解析SA新的合成途径，完善SA的生物合成以及为作物抗病育种指明了新的方向。
赵乔课题组近年来通过遗传分析、代谢组学分析和生物化学分析等手段，在苯丙烷途径的合成、代谢以及调控等研究中取得了一系列进展，揭示了拟南芥苯丙氨酸衍生物类黄酮合成途径调控的新机制（Wang et al., 2020），木质素合成与其前体苯丙氨酸合成共调控的分子机制（Geng et al., 2020），并以解析苯丙烷合成通路中的UGT72E家族功能为例，开发了特异针对糖基化合物的靶向代谢组和同位素标记前体化合物示踪相结合的新方法（Wu et al., 2022）。这篇论文进一步通过稳定同位素标记前体化合物示踪的方法，推翻了拟南芥可以通过PAL途径合成SA的假设。
赵乔课题组助理研究员吴杰为该论文的第一作者，赵乔研究员为通讯作者。中国农业大学化学系朱文涛副教授也参与并指导了该项研究工作。该研究得到了国家重点研发计划、国家自然科学基金、广东省合成基因组学重点实验室和深圳合成生物学创新研究院等的支持。
参考文献：
1. Wang, X., Wu, J., Guan, M., Zhao, C., Geng, P., and Zhao, Q. (2020). Arabidopsis MYB4 plays dual roles in flavonoid biosynthesis. Plant J. 101: 637-652.
2. Geng, P., Zhang, S., Liu, J., Zhao, C., Wu, J., Cao, Y., Fu, C., Han, X., He, H., and Zhao, Q. (2020). MYB20, MYB42, MYB43 and MYB85 regulate phenylalanine and lignin biosynthesis during secondary cell wall formation. Plant Physiol. 182: 1272-1283.
3. Wu, J., Zhu, W., Shan, X., Liu, J., Zhao, L., and Zhao, Q. (2022). Glycosides specific metabolomics combined with precursor isotopic labeling for characterizating plant glycosyltransferases. Mol. Plant 15: 1428-1443.
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