深圳先进院合成所司同课题组对羊毛硫肽衍生物文库的自动化构建和筛选

　　 11月15日，中国科学院深圳先进技术研究院司同课题组在国际学术期刊ACS Synthetic Biology发表研究论文“Robotic Construction and Screening of Lanthipeptide Variant Libraries in Escherichia coli”。作者依托深圳合成生物研究重大科技基础设施（简称“大设施”），开发了羊毛硫肽（lanthipeptide）衍生物文库在大肠杆菌底盘中的自动化构建和筛选技术，系统性解析了双组份羊毛硫肽haloduracin中α多肽的构-效关系，筛选得到K13V/A15R组合突变显著提升抑菌活性。实习研究员郭二鹏为文章的第一作者，助理研究员洪志来博士为文章的共同通讯作者。

　　核糖体合成后翻译肽（Ribosomally synthesized and posttranslationally modified peptide，RiPPs）是由核糖体合成，经翻译后修饰酶修饰获得具有特殊结构和活性的天然产物。羊毛硫肽是一大类RiPP，其特点是分子结构中含有一个或多个硫醚键连接的羊毛硫氨酸（Lan）和/或甲基化羊毛硫氨酸（MeLan）。在羊毛硫肽的生物合成过程中，前体肽基因先经转录翻译形成前体肽（Precursor peptide），然后被羊毛硫肽合成酶识别并在核心肽（Core peptide）中引入脱水和环化修饰。最终，前导肽被蛋白酶或转运蛋白的蛋白酶结构域移除，释放出具有功能活性的成熟羊毛硫肽。羊毛硫肽具有广泛的生物活性（如抗细菌、抗病毒、免疫调节等）和应用价值。 

　　作者在先前研究中，实现了多肽底物、合成酶、蛋白酶重组表达的时空调控，建立了羊毛硫肽及其衍生物在大肠杆菌中异源合成的通用方法。然而，该方法依赖手工操作，限制了工程改造的筛选通量和一致性。在本研究中，作者依托合成生物“大设施”（Biofoundry），针对羊毛硫肽衍生物库的构建和筛选过程建立了自动化实验流程和方法，包括前体基因突变文库构建、大肠杆菌转化、克隆挑取、液体培养与重组表达、MALDI-TOF质谱鉴定、琼脂抑菌实验等不同环节，可以在两周内快速合成和筛选大量羊毛硫肽衍生物（图1）. 　  

　　首先，作者验证了基于大肠杆菌自裂解系统能够在96孔板中产生成熟的haloduracin α多肽。随后，基于“大设施”的自动化平台，作者针对不参与成环的残基在前体基因中引入NNK简并密码子，成功构建定点饱和突变文库（Site-saturation mutagenesis，SSM）并获得了全部380个突变株。作者基于琼脂抑菌实验，快速获得了序列-活性数据，并结合进化分析、文献报道分析了关键位点和突变（图2）。根据琼脂抑菌筛选结果，作者挑选了表观活性优于野生型的衍生物分子进行摇瓶发酵和分离纯化，但并未观察到比活（specific activity）指标的提升，表明基于细胞裂解液和琼脂抑菌圈的筛选方法具有局限，推测结果可能被多种因素影响（如翻译后修饰、产量、琼脂中的稳定性和扩散能力等）。基于自动化平台，作者进一步开展了MALDI-TOF质谱鉴定和GFP融合表达分析，对衍生物的结构和产量进行分析。 

　　随后，作者进一步选择A环中Lys13、Ala15和Tyr16进行组合突变，这些位点对氨基酸突变具有高耐受性，且在同源序列中具有进化多样性。作者使用编码12种氨基酸的NDT简并密码子构建组合突变文库，通过DNA测序从4800个随机菌落中筛选得到1373个独特的三位点突变株（占理论文库容量12 × 12 × 12 = 1728的79.4%），通过琼脂抑菌实验获得序列功能关系（图3），并最终筛选得到Lys13Val-Ala15Arg组合突变可以显著降低对L. lactis指示菌的最小抑菌浓度。 

　　小结：依托深圳合成生物“大设施”，团队成功开发了羊毛硫肽天然产物衍生物文库的自动化构建和筛选方法。该自动化流程有望在未来加速大规模基因组挖掘发现新活性骨架、规模化解析构-效关系用于机理研究、数据驱动方法在药物分子开发中的应用。   

　　该成果得到了科技部重点研发计划、国自然面上和青年基金、南方海洋广东省实验室（广州）深圳分部、华大研究院开放基金和深圳合成生物学创新研究院等项目的支持。 


　　图1：A）自动化功能岛布局，B）羊毛硫肽突变文库自动化构建和筛选流程 
 

　　图2：A）halα单点饱和突变构效关系； B）前体肽基因进化保守性分析；C）halα和Ltnα功能结构域比较 


　　图3：halα- Lys13/ Ala15/ Tyr16三位点NDT组合突变构效关系