代谢工程谷氨酸棒杆菌高效分泌生产蜘蛛丝蛋白

摘要



    蜘蛛丝是一种由独特的蛋白质（蜘蛛丝蛋白）组成的特殊纤维，以浓缩水溶液形式储存在蜘蛛的主壶腹腺中并进行分泌。由于蜘蛛丝蛋白易聚集和表达宿主低分泌能力的缺点，结合蜘蛛分泌蜘蛛丝的特点启发了利用微生物分泌蜘蛛丝以纺成坚韧的合成纤维。该研究报道了代谢工程谷氨酸棒杆菌来高效地分泌重组的蛛丝蛋白。利用来自金丝网蛛（Trichonephila clavipes）的蛛丝蛋白MaSpI16（主要由16个重复单元组成的），研究人员首先在N端融合信号肽，确定了通过Sec蛋白转运途径可以分泌蜘蛛丝蛋白。然后通过信号肽优化、多水平代谢工程改造以及高密度发酵来提高蜘蛛丝蛋白的分泌表达水平。MaSpI16在培养基中较高的蛋白占比(>65.8%)和浓度(554.7 mg/L)使得易于分离纯化，最终纯度为93.0%。高溶解度的纯化蛛丝蛋白能够制备高浓度的水原液(高达66%)，易于纺成具有70.0 MJ/m3韧性的合成纤维。上述代谢工程和提取工艺同样适用于分泌生产更高分子量的蜘蛛丝蛋白MaSpI64（64个重复单元），以纺成具有类似韧性的合成纤维。这些结果表明了分泌生产蛋白质聚合物在纤维材料可持续供应方面的潜力。
 
主要内容
1、 依赖Sec转运系统的重组蜘蛛丝蛋白分泌及信号肽筛选
    谷氨酸棒杆菌有两种主要的分泌途径， Sec途径和Tat途径，具有其特定的信号肽将靶蛋白转运到培养基中。为实现蜘蛛丝蛋白的分泌表达，作者首先组装了密码子优化的合成基因MaSpI（编码16个重复序列），在其N端融合了Sec 或 Tat依赖的信号肽，并通过IPTG诱导这些融合基因的表达。结果表明依赖Sec转运系统的信号肽cg1514可以分泌目的蛋白（MaSpI）。作者进一步比较了依赖Sec转运系统的16个信号肽，发现cg2196信号肽最佳，相较于初始的cg1514信号肽，蛛丝蛋白产量提升了近两倍，因此后续实验选择cg2196信号肽。


                            图1. MaSpI表达和不同信号肽比较
2、  改造底盘菌株提高蛛丝蛋白分泌生产
    然后，作者分别从基因转录、翻译和分泌三个水平对底盘菌株进行了理性改造以进一步提高蛛丝蛋白的分泌水平。
   （1）由于编码蜘蛛丝蛋白基因高度重复性，通过减弱宿主中重组酶活性来提高重组质粒的遗传稳定性。因此作者敲除了谷氨酸棒杆菌基因组的编码关键重组酶的recA基因，使得MaSpI16和MaSpI64的分泌表达水平分别较对照菌株提高了13%和27%。
   （2）由于蜘蛛丝蛋白富含大量甘氨酸和丙氨酸，蜘蛛能够产生相应的大量tRNA，以满足蜘蛛丝蛋白合成过程中对tRNA的需求。因此，作者强化了编码甘氨酸密码子的tRNA基因表达（tRNAGly），结果表明MaSpI64蛛丝蛋白产量显著增加（15%），而MaSpI16蛛丝蛋白产量有轻微降低。
   （3）通过提高细胞壁通透性有望增强蜘丝蛋白的分泌，因此作者敲除了两个与肽聚糖合成相关的关键基因pbp1a和sigD。两种突变体分泌蛛丝蛋白的能力均有所提高，尤其是MaSpI64蛛丝蛋白的分泌，其中Δpbp1a突变株分泌蛛丝蛋白MaSpI64的产量较野生型提高了70%。然而，这两种突变的结合并没有进一步增加蜘丝蛋白的分泌。此外，单敲除pbp1a（Δpbp1a）较组合突变（ΔrecA和tRNAGly；Δpbp1a和ΔsigD；ΔrecA和Δpbp1a；tRNAGly和Δpbp1a）分泌了更多的蛛丝蛋白，说明蛛丝蛋白的转运途径是其分泌生产的主要障碍。


                            图2. 工程谷氨酸棒杆菌提高蛛丝蛋白分泌水平
3、高密度发酵生产蛛丝蛋白

    为进一步提高蛛丝蛋白产量，工程菌株（Δpbp1a）（分别含有质粒pCG8-I16cg和pCG8-I64cg表达相应的MaSpI16和MaSpI64）在5 L罐中进行高密度补料分批培养。通过葡萄糖补料发酵，OD600达到了 290，发酵液上清中分泌的MaSpI16含量达到554.7 mg/L，占总分泌蛋白的75.6%，而MaSpI64 产量最终达到了68.0 mg/L。


               图3. 高密度细胞培养分泌生产重组蜘蛛丝蛋白MaSpI16（A）和MaSpI64（B）

4、 蜘蛛丝蛋白分离纯化及其水相纺丝原液制备
    作者开发了一种蜘蛛丝蛋白纯化和浓缩制备的一体化工艺，该浓缩液可直接用于纤维纺丝。通过自主研发的低成本两步沉淀纯化方法，MaSpI16蛋白浓度可达~100 mg/mL 纯度约为93.0%，回收率84.9%；同样，MaSpI64的回收率为89.1%，纯度为47.1%。作者进一步对制备的蛛丝蛋白进行Western Blot验证，表明蛛丝蛋白在水溶液中显示无序特征，且在水溶液中大小一致，主要以单一蛋白链的形式存在，不存在蛋白聚集体。



                                 图4. 分离纯化蜘蛛蛋白和特性研究

5、 人工纺丝纤维特性表征
   最后，作者进行了人工纺丝制备，在纺丝中添加了不同百分数的蛛丝蛋白(MaSpI16:40%MaSpI16；MaSpI64:40%MaSpI64；MaSpI16HD:60% MaSpI16)，探讨三种合成纺丝中蜘蛛丝蛋白的分子量大小、纺丝液浓度与纺丝纤维力学性能关系。作者对纤维纺丝几个重要力学性能进行了分析，如极限拉伸强度（strength）、延伸性（extensibility）、弹性模量（纤维刚度的衡量指标）和韧性（toughness），结果表明MaSpI64和MaSpI16HD 较对照MaSpI16具有更好的力学性能。作者进一步通过扫描电镜分析了三种纤维纺丝的截面，并使用拉曼光谱研究了β-折叠沿纤维轴的排列情况（天然蛛丝的一个重要结构特征，有助于其特殊的力学性能）。



                                   图6.合成纤维的形态和结构表征

总结
    该研究首次建立了以谷氨酸棒杆菌为宿主的蛛丝蛋白高效分泌生产平台。在特定信号肽的引导下，蛛丝蛋白可通过Sec分泌途径转运到胞外；进而通过多水平代谢工程改造以及高密度发酵，实现了蛛丝蛋白在细胞外中的高水平、高丰度富集；通过自主研发的两步沉淀纯化方法，可获得纯度高达93.0%的蛛丝蛋白，纯化得率可达2.2 g/L。微生物分泌的蛛丝蛋白具有超越天然的水溶性，使得制备超高浓度的水相纺丝原液（高达66%）成为可能，进而成功纺成韧性高达70.0 MJ/m3的人工蛋白质纤维。