摘要    

    近日，浙江大学徐志南和连佳长实验室在Bioresource Technology杂志上在线发表研究论文High-level Secretory Production of Leghemoglobin in Pichia pastoris through Enhanced Globin Expression and Heme Biosynthesis，通过基因拷贝数优化和内源血红素途径强化，构建了一株能够高产分泌活性豆血红蛋白的毕赤酵母工程菌株。豆血红蛋白能赋予人造肉牛肉的风味和颜色，是一种重要的食品添加剂。在本研究中，首先通过转化后载体扩增(PTVA)和CRISPR/Cas9介导的基因组编辑工具增加豆血红蛋白基因拷贝数；然后，单独或组合过表达血红素通路基因，并研究其对豆血红蛋白分泌的影响；最后，回补ku70的豆血红蛋白表达菌株在10 L罐中进行高密度发酵，最终产量达3.5 g/L，血红素结合率达93%，是迄今报道的含血红素蛋白的最高分泌产量。豆血红蛋白的高水平分泌生产，无需补充昂贵的前体，保证了工程化毕赤酵母菌株在食品工业中的商业应用前景。

图1 工程改造毕赤酵母高效表达豆血红蛋白

主要内容

1. 多拷贝整合高产豆血红蛋白

    选择同源修复能力增强的GS115-Δku70作为亲本菌株，将豆血红蛋白表达盒整合到染色体AOX1位点，进行两轮PTVA以增加基因拷贝数和豆血红蛋白表达产量。基于豆血红蛋白的过氧化物酶活性，设计了一种用于选择高产菌株的高通量筛选方法。每轮PTVA后拷贝数和过氧化物酶活性均增加（图2a）。从两轮PTVA中选出的最佳菌株含有9个拷贝的AOX1p-LegH，命名为L9A。与含有一个AOX1p-LegH拷贝的初始菌株L1A相比，L9A的过氧化物酶活性增加了4.5倍（图2b）。为了进一步提升豆血红蛋白的产量，继续增加由不同启动子（包括AOX1p、TEF1p、GAPp和GCW14p）驱动的豆血红蛋白表达盒到L9A中，其中增加表达盒TEF1p-LegH的菌株L9A1T的产量最高，较L9A提升了34%。继续增加TEF1p-LegH和AOX1p-LegH表达框，菌株L10A1T的产量仅有微弱的提升（图2c），说明依靠继续提升基因剂量已无法进一步增加豆血红蛋白产量，其产量受其他因素的限制。

图2 基因剂量效应对豆血红蛋白表达的影响

2. 解除豆血红蛋白分泌的瓶颈

    推测限制豆血红蛋白的分泌的主要因素是受到胞内血红素的限制。为了验证假设，在摇瓶中外源添加1 mM的ALA和10 μM的血红素，如图3所示，添加 10 μM的血红素可将豆血红蛋白的比活力提升12%，而蛋白浓度相当。而添加1 mM的ALA不仅提高了豆血红蛋白的比活力，而且提高了发酵液中的豆血红蛋白的蛋白浓度。换言之，发酵液中不仅存在有活性的豆血红蛋白也存在脱辅基的豆血红蛋白，并且脱辅基豆血红蛋白可以被外源添加的血红素激活，但血红素似乎无法通过细胞膜，而小分子ALA可以穿过细胞膜，补充ALA增加了细胞内血红素的量，从而促进了豆血红蛋白的正确折叠和分泌。该实验说明了细胞内血红素对血红蛋白正确折叠和分泌的重要性。图片图3 外源补充ALA和血红素对豆血红蛋白产量的影响

3. 强化血红素途径分泌活性豆血红蛋白

    在明确了胞内血红素是限制豆血红蛋白产量进一步提升的主要因素后，尝试对血红素内源合成途径进行强化，以提高胞内血红素供应。将所有的血红素生物合成途径基因（HEM1、HEM2、HEM3、HEM4、HEM12、HEM13、HEM14和HEM15）都在AOX1p的驱动下过表达。其中HEM1基因过表达的菌株H1蛋白产量和过氧化物酶活最高，与外源添加ALA的效果相当（图4）。其余七个血红素途径基因过表达对过氧化物酶活略有提升，因此尝试组合强化血红素途径。同时过表达八个血红素合成途径基因的菌株HA的豆血红蛋白产量最高，在摇瓶中可达529 mg/L（图5）。图片图4 血红素基因单独过表达对豆血红蛋白产量的影响

图4 血红素基因单独过表达对豆血红蛋白产量的影响

图5 血红素基因组合过表达对豆血红蛋白产量的影响

4. ku70回补实现毕赤酵母高密度发酵

    虽然ku70敲除不会影响工程菌株在摇瓶发酵中的豆血红蛋白浓度和过氧化物酶活性，但在高密度发酵中，ku70回补菌株（HA-KU70）的细胞湿重和产量均显著提高，分泌了3.5 g/L豆血红蛋白，且血红素结合率达93%（图6）。考虑到在同一启动子（AOX1p）控制下的多个表达盒的整合，重组菌株的稳定性可能是产业化的一大问题，因此,工程菌株HA-KU70在非选择性条件下通过连续传代100代进行了稳定性测试，之后随机分离出的10个菌株表现出与KA-KU70相似的发酵性能，表明该重组菌株在实际应用中具有较高的稳定性。    
图6 豆血红蛋白表达菌株的高密度发酵    

总结     
    通过增加基因拷贝数和强化内源血红素合成途径构建了能够高效分泌豆血红蛋白的毕赤酵母菌株。在高密度发酵中，豆血红蛋白产量和血红素结合率达到3.5 g/L和93%，是迄今为止在GRAS微生物细胞工厂中的含血红素蛋白的最高表达水平，有望实现工业化。同时，文中的代谢工程策略也可用于在毕赤酵母中表达其他含血红素蛋白。